袁进
广东省精准医学应用学会眼前段疾病分会主任委员
中山大学中山眼科中心副主任
近日，中山大学中山眼科中心副主任、广东省精准医学应用学会眼前段疾病分会主任委员袁进教授团队联合中国海洋大学王岩教授团队在生物医学工程领域权威期刊BioengineeringandTranslationalMedicine杂志上以Researcharticle发表题为“DevelopingaNewTreatmentforSuperficialFungalInfectionUsingAntifungalCollagen-HSAFDressing”的研究论文。研究者采用来源于海洋的产酶溶杆菌LeYC36菌株，通过高纯度的发酵提取工艺获得新型抗真菌化合物热稳定抗真菌因子（Heat-StableAntifungalFactor,HSAF），构建了胶原负载的缓释系统，证实其可抑制真菌菌壁鞘脂的合成，阻止菌丝生长，在真菌性角膜炎和真菌性皮肤感染模型中证实了其优良的抗真菌效果，为真菌性角膜炎和真菌性皮肤感染等真菌体表感染疾病提供了全新的药物选择。
感染性角膜炎是发展中国家最常见的致盲性眼病之一，其中真菌性角膜炎是最常见的感染类型，真菌性角膜炎起病缓慢、病程长，角膜结构和功能受真菌菌丝侵袭，角膜穿孔率高达30%以上。其早期主要依赖于抗真菌药物，但临床缺乏广谱高效的抗真菌药物，且眼用剂型的生物利用度低。因此，开发新的抗真菌药物及剂型一直是学科领域的研究重点。
该研究发现海洋来源的LeYC36可以产生丰富的次生代谢产物，抑制多种真菌和细菌的生长，其中一种代谢产物HSAF属于大环内酰胺类化合物，可以通过抑制真菌细菌壁中鞘磷脂的合成抑制真菌活性，通过调节生长环境中NaCl的浓度可使LeYC36产生远高于天然本底的HSAF生成量。
图1：微环境调节LeYC36提高HSAF表达量
研究团队通过大孔树脂吸附、甲醇洗脱和高效液相色谱纯化从LeYC36中提取到纯度高达95.3%的HSAF，并证明了提取得到的HSAF对包括烟曲霉菌、克柔念珠菌、腐皮镰孢霉菌、黑曲霉菌等多种病原真菌具有抑制作用。
图2：LeYC36提取HSAF工艺流程
研究团队进一步发现信号分子吲哚可以通过双组分系统QseC/QseB调控LeYC36中多种次生代谢产物特别是HSAF的表达量，信号分子吲哚的刺激可以使HSAF产量显著性提高5倍，极大提供了工程菌定向表达分泌的效率。
图3：吲哚上调LeYC36中HSAF表达机制
HSAF做为脂溶性化合物，只能溶解于有机溶剂且在水中分散性较差、生物利用度低，这些成为了其在未来临床上的应用阻力。因此，研究团队进一步通过自组装生物膜负载技术，成功将HSAF制成具有缓释效果的胶原复合剂型（Col-HSAF），自组装的生物膜具有致密的层状结构，形成药物负载空间，并且具有较好的透光性和力学强度。
图4：Col-HSAF的电镜结构及药物缓释曲线
细胞*性实验证明Col-HSAF具有良好的生物相容性，HSAF能够从Col-HSAF中缓慢释放达2周，抑制菌丝形成和孢子群落活性，抑制真菌的生长。药代动物模型中通过液相色谱质谱联用法(LC-MS/MS)检测发现，角膜药物达峰时间为3小时，能够在角膜、结膜、房水中维持有效浓度约1-2周，结膜、角膜和房水中药物达峰浓度分别为.±.ng/mL、.±.ng/mL和99.±.ng/mL。Col-HSAF的构建大幅提高HSAF生物利用度。
图5：Col-HSAF剂型具有良好的载药缓释能力和抑菌活性
明确Col-HSAF眼部药物代谢动力学规律后，研究人员建立真菌性角膜炎小鼠模型进行疗效验证，结果显示Col-HSAF干预组比伏立康唑治疗组的角膜临床评分显著降低，角膜载菌量下降，HE染色显示基质内炎性细胞浸润减少。同时荧光显微镜及双光子显微镜角膜铺片菌丝可视化检测，证实Col-HSAF治疗组小鼠角膜菌丝数量密度显著降低。
图6：Col-HSAF降低角膜载菌量，减轻炎性浸润，有效治疗真菌性角膜炎
为了进一步拓展Col-HSAF抗真菌应用场景，研究人员建立白色念珠菌皮肤感染模型，分别应用Col-HSAF和常用于皮肤给药的羊毛脂膏剂作为载体（HSAF-Lanolin）进行干预，结果提示可以有效降低感染皮肤载真菌量，减少皮下肉芽组织的形成、炎症细胞浸润，并能改善毛囊萎缩、结缔组织疏松及皮脂腺退化等病理损伤，该剂型促进皮肤感染伤口的愈合效能优于克霉唑软膏。
图7：HSAF剂型在白色念珠菌皮肤感染模型中，能够抑制真菌活性，减少炎症细胞浸润，促进组织修复
总体而言，该研究首次从从海洋来源的LeYC36中提取HSAF，并通过高效、高纯度的提取工艺使HSAF的纯度达到95.3%，进一步通过添加外源的信号分子吲哚来增加HSAF基因簇的表达和产量的提升，通过体内体外实验证实LeYC36产生的HSAF能够显著抑制真菌活性，构建的眼部及皮肤缓释给药新剂型，提高了HASF的生物利用度，在烟曲霉菌角膜炎模型和白色念珠菌皮肤感染模型中证实了其优良的抗真菌效果，为临床提供了眼表和皮肤抗真菌药物新选择，该成果即将进入到转化阶段。
图8：HSAF治疗真菌性角膜炎和皮肤真菌感染的机制示意图
该研究得到国家自然科学基金、眼科学重点实验室开放基金等项目支持。中山大学中山眼科中心钟菁博士后、中国海洋大学闫夏漪、中山大学中山眼科中心左欣和赵轩博士后是文章的共同第一作者，中山大学中山眼科中心袁进（最后通讯）和中国海洋大学王岩是本论文的共同通讯作者，内布拉斯加大学林肯分校杜良成教授团队与山东大学李瑶瑶教授团队参与了本项工作。中山大学中山眼科中心、眼科学国家重点实验室为第一单位。