前面我们讲过双重RNA-Seq测序技术用来研究宿主与感染的病原体的基因表达情况，自然而然就会想到是否可以进行三重、四重甚至多重转录组测序来同时分析多个物种之间的基因表达情况。于是小编尝试在Pubmed数据库中检索，发现在年底发表了一篇关于“TripleRNA-Seq”三重RNA测序的方法，用于研究被人巨细胞病*和烟曲霉共同感染的体外树突状细胞的文献。该文献是发表在CellRep杂志上，名为TripleRNA-SeqRevealsSynergyinaHumanVirus-FungusCo-infectionModel的研究。
今天我们就一起来学习一下这一篇文献，基于我们想对三重测序技术本身有更多的了解，所以我们重点介绍该研究过程中所涉及的一些具体方法。需要大家注意的是，目前该技术仅限于这一篇研究中，暂时在市面上还未见有提供这类的科研服务。
01
研究背景
侵袭性曲霉菌病（IA）主要引起肺部感染，是造成移植后死亡率和医疗成本负担加重的重要原因。此外，包括人类巨细胞病*（CMV）肺炎在内的CMV相关感染，仍然是同种异体干细胞移植（alloSCT）受者中最常见的感染并发症。大量证据表明，CMV改变人体免疫反应以逃避宿主监测并建立潜在的持久性。例如，CMV分泌的免疫抑制细胞因子同源物抑制树突细胞成熟和存活以及树突细胞介导的T辅助（Th）细胞活化和Th1分化。而作为IA疾病最常见的致病因素的烟曲霉可抑制人类T细胞对巨细胞病*的激活。
但是，CMV和烟曲霉对人类单核细胞功能的不同影响以及共感染中的相互免疫防御的分子事件在很大程度上是未知的。高通量测序技术常用于研究不同的生物学过程，但当把相互作用的生物体分开单独进行转录组测序时，可能会影响物种间相互作用信息的识别。本研究开发了三重RNA-Seq测序技术，应用于用两种肺部病原体人巨细胞病*（CMV）菌株TB40和烟曲霉感染的人单核细胞衍生的树突细胞（moDCs）。
02
样本来源
单核细胞衍生的树突细胞、人类巨细胞病*和烟曲霉。
03
研究设计
以未感染的细胞和病原体为对照，以两种病原体单一感染和共同感染的细胞为研究对象，进行三种生物表达基因的差异分析。
04
研究中涉及的方法及分析
1、确定共感染参数等最佳实验条件
因为该文献的重点是研发三重RNA-Seq测序技术，所以作者进行了多种尝试，比如以未感染的细胞和病原体转录组测序作为对照，比较两种不同病原体感染顺序、感染时间后的差异情况等。考虑到病原体感染后对宿主和其自身基因表达都有影响，还预先开展实验对各种实验条件进行摸索和筛选，最终确定最佳实验方案。
在我们自己的研究中，基于我们所用的宿主细胞以及感染源与文献中的有异，我们在尝试该技术时最好也先开展预实验来确定各种合适的条件，比如提取RNA时合适的细胞裂解条件、获取合适总量RNA的条件以及不同病原体感染顺序对宿主基因表达的影响等。
本研究中经过实验确定了经CMV或烟曲霉单一感染的moDC的裂解条件、有效核糖体RNA去除参数等。然后设置三种情况：（1）moDC先感染CMV，4.5小时后再感染烟曲霉；（2）先感染烟曲霉，2小时后感染CMV；（3）同时感染两种病原体。同时收集感染9小时后的这三种情况下的细胞进行三重RNA-Seq测序。最后将共感染数据与来自单一感染（与共感染平行收获）的转录组数据和来自未感染的moDC或烟曲霉单一培养物的数据进行比较。
图1三重RNA测序方案设计
2、RNA富集法
本研究所涉及的3种生物的RNA文库构建中，使用去除rRNA的方法或基于poly（A）富集法都可以实现，不过考虑到可获得更多转录产物信息，最终选择去除rRNA法。在我们自身的研究中在选择富集RNA时也需要考虑这些问题，如果研究的所有生物的mRNA都有poly（A）结构，则两种方法都可以选择；反之，如果有一些不存在poly（A），那只能选择rRNA去除法。
图2两种文库构建法比较
3、测序深度
由于是三重RNA-Seq测序，需要充分覆盖三种生物的转录组，所以测序深度需要增加。本研究基于双重RNA-Seq的测序基础，将三重测序增加了5倍，最终得到了15M去除rRNA后的宿主reads。经过数据比对后发现虽然大部分数据都比对到人的参考基因组上，但烟曲霉占比达24%，CMV占比达1.6%。这些数据足以进行基因差异表达分析，并且与双重RNA-Seq测序推断出的预测结果相一致。
在我们现实的实际研究中，我们知道双重RNA-Seq测序时一般建议总测序数据量是10G，那如果尝试三重RNA-Seq测序时数据量我们建议根据实际情况稍作增加。比如两种感染源都是真菌和两种感染源都是病*数据量方面肯定是前者要更大一些。
图3比对到各个基因组上的数据比例
4、分析方向
前面提过该文献的重点放在中间一些我们可以参考的方法上，所以对分析这里简单而过。该研究的分析包括：（1）比较单一感染源与共同感染后转录组的差异；（2）三种相互作用生物中的差异基因表达谱；（3）宿主对共感染的反应表明烟曲霉和CMV之间的协同作用；（4）对差异表达变化基因进行qPCR等基础实验验证。
从分析方向可以看出，该文章的分析都是转录组测序的常规分析，寻找差异表达基因并就感兴趣的点进行深入挖掘，最后对差异表达基因进行验证。整个文章的亮点就是三重RNA-Seq这个方法的建立，这也为我们的课题设计提供一些借鉴。
好啦，本期的技术分享就到这里啦，希望这些技术在感染领域的研究中能发挥一定作用。
参考文献
TripleRNA-SeqRevealsSynergyinaHumanVirus-FungusCo-infectionModel.
最后
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