简介
传统上，真菌感染的实验室诊断依赖于真菌病原体的分离和染色后对临床标本直接显微镜检查。培养真菌病原体，尤其是丝状真菌，通常需要1-2周的时间，即使成功分离出真菌，准确鉴定也很有难度。因此，抗原和抗体检测越来越多地使用以实现更快速和特异性的诊断。
真菌感染最敏感、特异和广泛可用的抗原或抗体检测试验是隐球菌抗原测定法。然而，大多数其他抗原或抗体检测存在缺陷，例如非特异性（β-d-葡聚糖检测）、不敏感（半乳甘露聚糖抗原和抗体检测）和仅在内部可用（马尔尼菲篮状菌和烟曲霉抗原和抗体检测）。
近几十年来，DNA扩增和测序越来越多地用于真菌感染的实验室诊断。用于PCR和定量实时PCR扩增的真菌特异性引物已被用于诊断曲霉属、念珠菌属、毛霉菌属和卡氏肺孢子菌感染。也可以通过扩增抗性基因和挑选突变来检测抗真菌抗性，例如唑类抗性烟曲霉菌株中Cyp51A中的TR34/L98H。在过去的10年中，针对DNA标记（内部转录间隔区(ITS)和28SnrDNA（D1/D2区）以及Sanger测序）的泛真菌PCR分析已被广泛用于鉴定分离的真菌以及直接从临床标本中检测真菌病原体。由于PCR引物的设计方式是它们将退火并扩增保守的目标区域，因此理论上它们能够从临床样品中提取和识别任何真菌。近年来，新一代测序（NGS）技术已经超越了研究领域，并开始走向成熟的临床应用。NGS最初的用途主要是进行基因组测序，补充然后取代传统的基因组测序方法，包括DNA片段的克隆、通过Sanger测序和基因组步移对单个克隆进行测序，以及测序克隆的组装。随着测序化学、计算机硬件和软件以及计算能力的进步，新的NGS平台和版本已经以指数规模产生。不同的NGS平台各有优缺点。Illumina、MGI的DNBSEQ和IonTorrent平台等短读长测序仪的错误率低且每个碱基的测序成本低，因此应用广泛。这些平台提供不同的测序仪型号，可用于多种用途和各种规模的测序通量，从高通量（Illumina的HiSeq系统，高达Gb）到台式和低通量（Illumina的MiSeq系统，15Gb），最大读取长度为bp。PacificBiosciences(PacBio)和OxfordNanoporeTechnologies平台等长读长测序仪可以产生≥50kb的长读长，有助于从头基因组组装和重复基因组区域的解析。然而与其他NGS平台相比，PacBio平台需要更多的DNA（以微克为单位的数量）且读取准确度较低。OxfordNanoporeTechonologies最近发明的MinION设备成本低、周转时间短和便携尺寸，加快了NGS在实验室诊断中的应用。使用mNGS进行实验室诊断仍然昂贵且劳动密集型，并且需要专业知识，特别是生物信息学分析部分，因此仔细选择患者对于产生最高产量和使其最具成本效益至关重要。最适合使用mNGS进行实验室诊断的患者是培养阴性的临床综合征，无论是不明原因的发热，还是临床特征已经指向特定器官系统，如脑膜炎。已经进行了初步调查，包括培养、各种血清学测试甚至分子测试，但仍然不知道患者患有什么疾病。在使用mNGS之前，临床标本需要进行泛细菌、泛真菌PCR等，然后进行泛测序。样本通常是无菌的身体标本，如血液、脑脊液、腹腔液等。图使用新一代测序(NGS)诊断疑似真菌感染的工作流程
实验室诊断
在年6月1日使用关键字（“fungalinfection”OR“fungalinfections”OR“fungaldisease”OR“fungaldiseases”ORmycosis)AND(“nextgenerationsequencing”ORNGSORmetagenomicsORmNGSORcfDNAORmcfDNA)）对PubMed数据库进行了文献检索并综述。自年首次报告病例以来，已有超过例mNGS诊断的真菌感染病例。耶氏肺孢子虫（Pneumocystisjirovecii）最常见，约占检测到的真菌的25%，其次是曲霉属（22%）、念珠菌属（16%）、隐球菌属（7%）、根霉属（6%）和镰刀菌属(4%)。在约12.5%的病例中，mNGS检测到不止一种真菌。mNGS诊断的P.jirovecii感染，所有91名患者都患有肺炎，只有1名患者为HIV阳性。而P.jirovecii的一般流行病学中HIV感染是最重要的危险因素。两者存在很大的不同。这可能是因为对于患有P.jirovecii的HIV阳性患者对于感染，他们呼吸道中的真菌负荷通常很高，并且直接使用甲胺银染色，有时甚至使用诱导痰样本，通常足以做出诊断。相比之下，其他免疫功能低下的患者，真菌负荷通常较低，必须进行支气管镜检查以收集产量更高的样本。使用mNGS进行实验室诊断的最重要和最吸引人的优势是它可以检测所有病原体。由于它对临床样本中存在的所有DNA进行测序，因此理论上它将能够检测细菌、真菌、DNA病*和寄生虫。如果怀疑RNA病*，可以增加逆转录步骤。但是，mNGS也有一些局限性。临床样本中检测到P.jirovecii或T.marneffei常是患者感染的原因，但曲霉菌、念珠菌或其他一些真菌序列的存在，有时可能只是定植菌甚至污染物必须非常小心地解释。利用mNGS在一名右侧髋关节假体患者的术中滑液和假体超声处理液中检测到黑曲霉序列和表皮葡萄球菌；从术中标本中分离出了表皮葡萄球菌，而没有曲霉。黑曲霉应该具有抗药性的氟康唑用于治疗感染；但是感染被治愈了。这些表明黑曲霉序列可能只是该患者的污染物。错误地确定感染的病原体会给患者带来很大的风险，可能导致完全没有必要的潜在有*药物或有害方法对患者进行过度治疗。应向医生提供培训，让他们了解mNG技术，解释mNGS结果时也应咨询临床微生物学家。在现阶段，mNGS广泛用于真菌感染实验室诊断的主要障碍仍然是NGS的高成本。当mNGS的成本进一步降低，专业知识变得更广泛并克服其他障碍时，NmGS在实验室诊断中的常规使用将依赖于计算能力。不管用于实验室诊断的方法是什么，它都涉及从样本中提取数据并将收集到的数据与数据库进行匹配。识别丝状真菌的传统方法包括提取形态数据并将其与教科书中的图像进行比较。对于其他方法，例如生化测试、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)以及ITS和其他保守区域的Sanger测序，数据库的文件大小通常相对较小，计算数据比较所需的内存通常要求不高。因此，此类数据库可以下载安装在用户计算机本地进行计算。而mNGS数据分析的数据库的文件大小超过Gb（截至年4月12日），需要更大的内存才能在本地执行序列搜索。未来我们期待mNGS成为实验室诊断真菌感染的有用工具，帮助发现新的真菌病原体，尤其是那些不易分离的病原体。文献：[1]TsangC,TengL,LauS,etal.Rapidgenomicdiagnosisoffungalinfectionsintheageofnext-generationsequencing[J]..10年丰富临床服务经验分子遗传学检验领导品牌提供全技术平台解决方案基于人工智能的生物信息分析体系内容丰富贴近临床的检测报告业内最短的报告周期专业的遗传咨询服务体系北京康旭医学检验所海淀区杏石口路益园文创基地C区10号楼-