年3月31日，挪威科技大学的MargretheGaardl?s等人在bioRxiv-Biochemistry上发表了题为：AmechanisticbasisforunderstandingthedualactivitiesofthebifunctionalAzotobactervinelandiimannuronanC‐5epimeraseandalginatelyaseAlgE7的研究论文。
Abstract
甘露聚糖C-5异构体酶和褐藻胶裂解酶是调节褐藻胶功能性质的重要酶。异构化反应和裂解酶反应的反应机理是相似的，如来自棕色固氮菌的AlgE7，可以执行这两个反应。这些酶与没有裂解酶活性的甘露聚糖C-5差向异构酶有很高的序列同源性，其双重活性背后的机制尚不清楚。在这项研究中，我们研究了与AlgE7的双功能褐藻胶裂解酶和同分异构酶活性有关的机制决定因素。在序列分析的基础上，构建了一系列AlgE7变异体，并进行了活性分析和核磁共振(NMR)产物表征。钙促进了AlgE7的裂解酶活力，而NaCl则降低了该裂解酶的活力。利用明确的褐藻胶底物，发现AlgE7的优先切割位点为MXM和G
XM。通过对变异体的研究发现，R对AlgE7裂解酶的活性特别重要，我们得到了纯正的差向异构酶变异体。此外，实验结果还表明，催化反应机理为：H为催化碱，Y为催化酸。这项研究通过更好地了解反应机理以及两种酶反应如何随着反应条件的变化而改变，从而为褐藻胶异构体酶和裂解酶的进一步应用打开了大门。
01
研究简介
褐藻胶修饰酶，特别是同分异构酶和裂解酶，可用于调整食品、医药和材料用褐藻胶产品的物理性质。褐藻胶的M/G组成和分子量一起决定了聚合物的性能和应用领域，包括凝胶形成能力。用同分异构酶和裂解酶进行的酶后聚合修饰对聚合物的功能性质非常重要，这与聚合物的粘度和凝胶形成能力有关。底物识别所涉及的酶残基对于底物特异性、对异构化序列的优先攻击以及沿着底物的行进运动都是重要的。以前的研究表明，微小的序列差异通过底物与远离活性位点的残基相互作用来影响活性和产物模式。作用于铝酸盐的同分异构酶和裂解酶被认为具有相似的反应机制(图1)。第一步，涉及催化碱(图1中表示为AA2)，对于这两个反应是共同的，而不同之处在于涉及质子给予的步骤(图1中表示为AA3)。在这里，从糖环的另一侧给C5的质子会导致异构化，而给糖苷键的质子会导致裂解。所有的褐藻胶异构体都有一个共同的YG(F/I)DPH(D/E)基序，在ALGES中保守为YGFDPE(编号根据AlgE7)。有助于切割的酶残基可能存在于该基序之外，该基序对于双功能的ALGE酶也是保守的。在YGFDPHE基序中，酪氨酸(Y)和组氨酸(H)被认为是催化碱和酸(在图1中表示为AA2和AA3)。在这里，我们研究了AlgE7双重活性的作用方式，并通过在活性位点及其周围产生氨基酸取代的酶变异体来阐明其催化机制。在不同的反应条件下，改变NaCl、底物和CaCl2的浓度以及pH，进一步探索了反应模式。图1：提出的褐藻胶裂解酶和差向异构酶反应机理。这两种机制都始于AA2(氨基酸2)从C-5中提取质子，需要AA1对羧酸盐进行电荷中和。在裂解反应中，质子被给予糖苷键的离开基团，而在EP异构酶反应中，质子被给予糖环以生成同分异构体。图中仅显示了M-裂解酶反应。02
主要结果
催化裂解酶/差向异构酶机制的阐明
①裂解酶和异构化活性是相互依赖的为了验证最终产物并进一步阐明作用模式，我们在不同的反应时间点使用了1HNMR、13CNMR和13CHSQC(异核单量子相干谱)（图2）。结果表明，AlgE7具有切割G↓XM的偏好，然而，如果酶确实有这种偏好，那么在反应过程中，当G-含量由于异构化而增加时，预计会形成更多的G-还原端。然而，从图2A中1H光谱的积分来看，在反应过程中，M-和G-还原端的形成速率大致相同。当以聚MG为底物时，图案发生了变化。1H谱和时间分辨谱显示裂解酶活力降低，出现一个很小的ΔG信号，几乎没有产生mred。这一发现对应于裂解位点G↓XG上的弱活性，而这一活性在Polym上没有发现。从时间分辨光谱中我们可以看到，随着MG-嵌段的填充，产生了富含G-嵌段的褐藻胶。发现纯寡核苷酸完全缺乏活性，不包括G-块内的切割。总之，底物的异构化程度似乎对裂解酶的活性非常重要。图2A和B所示的光谱是用75mMNaCl记录的，但1HNMR谱也是在缓冲液中没有NaCl的情况下记录的。13CNMR-在不含NaCl的聚丙烯上的实验显示了与这里讨论的相同的趋势，除了在反应过程中完全缺乏MGG信号。裂解酶活性在没有盐的情况下似乎更占优势。高效阴离子交换色谱脉冲安培检测(HPAEC-PAD)用于在NaCl存在下异构化60h的样品。AlgE7显示了一种不同于作用于类似底物的M-和G-特异性裂解酶的模式，反映了异构化样品的分离导致的更复杂的产物模式。图2：核磁共振波谱显示AlgE7作用于Polym和PolyMG。带下划线的单体残基产生信号，它们根据最近的相邻残基给出不同的峰。表1：~3H法和裂解酶法检测Polym上的AlgE7变异体的结果。所有结果均以野生型(Wt)百分比表示。图3：A：序列比对图。B：A中突出显示的残基，显示在AlgE4(右)(2PYH)的晶体结构中和AlgE7的同源模型(左)中，具有与A中突出显示相同的色码。破折号显示在可能形成氢键的残基之间。结构稳定所需的钙离子被视作一个橙色的球体。②双功能酶裂解酶活性的分子基础及中心残基R的鉴定
我们检查了底物结合槽和活性位点周围的序列差异。将AlgE1的N-末端个氨基酸与AlgE7的相应序列交换(产生嵌合酶AlgE7-AlgE1)，得到了一种双功能酶。因此，突变研究集中在AlgE7的N端部分(残基G-I)，即A-模块。在双功能裂解酶/差向异构酶和差向异构酶之间，结合槽中的几个氨基酸残基不同。这在AlgE7A的蛋白质序列的比对中得到了说明，与三个双功能A-模块(ConL)和来自棕色弧菌和嗜铬假单胞菌(CONE)的十个同向异构酶A-模块的共同序列进行了比较(图3A)。在结合槽中形成广泛的氢键网络，如图3B中的虚线所示。这样的网络早些时候已经被证明对表异构酶的结合和进行作用很重要。根据图3所示的顺序和视觉分析，总共创建了30个树状的AlgE7单一氨基酸替换和组合变体。我们测量了反应时间间隔为5分钟的吸光度，计算了初始吸光度，并与野生型的吸光度进行了比较。对于其中的22个变异体，我们还进行了48h的酶反应，并用1HNMR分析了反应结束时的产物图谱。图4显示了18个变异体的结果，而DA、DN、YA和DA没有检测到活性。表1和图4中的结果描述了变体之间的质的差异。E、Y、R和K残基在双功能酶中都是保守的，而K、F、G和L残基在同分异构酶中是保守的。在同分异构酶中，K与保守残基D形成盐桥。在双功能酶中，残基是谷氨酸，与D相互作用的正电荷由R提供。双功能酶中的K在活性位点残基Y附近引入一个额外的正电荷。Y/F是四个残基中唯一靠近催化组氨酸的残基，它在活性位点引入了一个极性基团。单一突变体RG，它几乎完全取消了裂解酶活性，同时保留了同分异构酶活性(表1和图4)。由于它对裂解酶活性的重要性，我们还纯化了RG变异体，并在多聚MG和多MG上进行了与上述野生型相同的1H-NMR、时间分辨13C-NMR和HSQC实验。RG与野生型一样产生G-残基和GG-二聚体，但速率较慢。在PolyMG上，它还显示了从GGG峰的外观创建更长G块的能力，类似于野生型。与野生型一样，NaCl影响异构化活性，特别是影响酶在PolyMG上产生G-阻滞剂的能力。相反，EK/L和KL/R保留了与野生型相似的裂解酶活力(表1)和产物谱(图4)。为了研究所提出的催化酸和碱在反应中的作用，我们创建了活性位点变体YA、YF、YH、HF和HY。如表1所示，位于第位的三个变异体的残留酶活性均为野生型的0.5%左右。HY显示出类似水平的残存裂解酶活性，而HF的活性接近检测限。对另外两个活性位点残基D和D也进行了研究，产生了变异体DE、DN、DE、DN和DR。DN和DN的残留活性均高于DE和DE。这意味着这些残基的大小比它们的负电荷更重要，这与我们对另外两个天冬氨酸D和D的观察结果相反。图4：作用于1mg/ml多聚物，加入2.5mMCaCl2，在25°C孵育24小时的野生型和变异型终点1HNMR的产物图谱。绿色，内部G-残基；橙色，Δ-残基；深绿色，内部M-残基；深紫色，还原端的M-残基；以及浅紫色，还原端的G-残基。这些分数之和等于1。图5：核磁共振谱显示RG在PloyM和PloyMG上的活性。带下划线的单体残基产生信号，它们根据最近的相邻残基给出不同的峰。③通过改变反应条件，观察到了对双重活性的复杂影响
我们对NaCl的影响进行了更详细的研究，以确定加入不同浓度的NaCl是否会影响它们的相对活性。并对不同钙浓度、pH值、底物浓度等反应条件进行了试验。采用析因实验研究了添加氯化钠(0、50、和mM)、氯化钙(0、1和3mM)、pH(6、7和8)和底物(1和0.mg/ml)的组合。所有的实验都含有0.16-0.25毫米的钙。裂解酶活性用检测A增加的分光光度法测定，并计算初始斜率(图6)和终止值。随着NaCl浓度的增加，AlgE7的初始裂解酶活力降低，但加钙对酶活力的影响较小。对于3mM钙，50mMNaCl下的活性与0mMNaCl下不加钙时的活性相当。在无NaCl存在的情况下，pH8的酶活约为pH6的1.5倍，但pH6的酶活受NaCl浓度的影响小于pH8。带正电的残基参与底物相互作用，并通过R和K参与裂解反应，pH值对这些残基的质子化有影响。在高钙和高底物浓度下，mM盐除了在pH为8时外，并不能完全抑制该反应。在相同的反应条件下，底物浓度为1mg/ml时，所有酶的活性都比底物浓度为0.mg/ml时高，但在低底物浓度和高底物浓度时的变化趋势是相同的。但在pH为6，无氯化钠和1-3mMCaCl2的条件下，酶在0.mg/ml底物上的活力与在1mg/ml底物上的活力相当。为了同时分析异构化和裂解反应，用时间分辨核磁共振仪(图6，下图)测试了不同浓度的NaCl和钙在pH7和9mg/ml的聚丙烯酰胺溶液中的浓度。裂解酶实验与核磁共振实验的一个重要区别是后者的底物浓度要高得多(裂解酶实验的底物浓度为9mg/ml，而裂解酶实验的底物浓度为0.-1mg/ml)。图6：野生型AlgE7的盐依赖实验。03
讨论
AlgE7野生型的作用方式
总体而言，与PolyMG相比，AlgE7在作用于PolyM时具有更高的裂解酶活性，而且它根本不切割纯G底物。从图2显示的核磁共振结果中，我们发现当富含M的海藻酸盐为底物时，潜在的洗脱位点是G↓XM和M↓XM。当底物几乎只含有MG-交替残基时，G-↓GM是首选的切割位点，因为主要产生G-red和ΔM，底物几乎不含MM-序列。对应于ΔG和MRED的小峰值也允许G↓XG，这在Polym中找不到。这两种底物的潜在切割位点如图7所示。
我们假设，异构化和裂解都可能发生在同一结合事件中，其中藻酸链的裂解代表了产物解离和释放之前的最后一步过程。或者，这可能是M块两侧的MG块和MG块两侧的G块的减少端的首选攻击的结果。这两种假说都可以解释为什么我们在由多聚物生成的产物的还原端看到大致相等数量的G-和M-残基。这也可以解释为什么我们没有在富含M的底物上观察到ΔG信号，因为如果AlgE7与AlgE4朝相同的方向移动，它只会在不太可能的情况下产生那些信号，即它到达另一个MG块的末端。裂解酶反应的不同潜在底物的特性可能对该酶的底物专一性和产物的形成很重要。与交替的MG或连续的G-残基相比，连续的M-残基在链中的伸展程度更高。图7：根据观察到的AlgE7在Polym(左)和PolyMG(右)上的产物模式，说明可能的切割位点。异构化和环化的酶学机制
各种底物的准确位置可能决定是否发生异构化或切割，但为什么只有一些AlgE异构体酶(如AlgE7)是双功能的，这一定是由于酶的特定序列决定因素。我们不能确切地知道Y或H中哪一个残基负责提取质子(图1中的AA2)，但我们认为H是质子提取器，Y是M-糖的催化酸(图8)。如图7所示，由观察到的产物施加的方向性似乎排除了Y可以从M残基中提取H-5质子的可能性。双重活性可能是由Y相对于底物的准确定位以及它与+1亚位点残基的C5或O4的接近程度决定的。ConL和CONE之间的序列差异在Y附近最大，即、和位残基，以及突变体AvAlgE7-RG、AvAlgE7-RK和AvAlgE7-EK-KL的活性，有力地支持了这一点。
E、R和K可能通过静电相互作用将底物残基定位在活性位点和活性酪氨酸Y上，并干扰Y和底物的pKa。这可能会影响Y是把质子给糖环的另一面(异构化)，还是给糖苷键(裂解酶反应)。我们的结果表明，裂解酶反应是由氨基酸负责的，而不是先前提出的水分子，因为含有RG的变体几乎失去了所有裂解酶的活性。
突变体EK、YF和KL对裂解酶活力的影响没有R大。然而，它们确实在还原端产生了比M-残基更多的G-残基，而不像野生型那样产生类似数量的G-残基。这一点在结合了所有三种氨基酸替代的变异体中更加明显。如果我们基于图7所示的场景进行讨论，作用于Polym的野生型中的切割事件在G
MM或M
XM随机发生。当这一点在EK、YF和KL中改变时，可能是因为底物在活性位点的位置发生了变化，使得G
MM比M
XM更有可能发生切割。
活性位点周围带电残基之间的氢键网络可能对所有Alge异构体酶的过程作用方式都很重要，而不仅仅是催化机制。在AlgE4中，K与D形成氢键，D与底物紧密结合，与Y(21)的骨架形成氢键。AlgE4中的DA不像AlgE7中那样对活性有害(图4，表1)，而D和R的电荷的去除大大降低了活性。另一方面，DE变异体保留了野生型的一半活性，而RK只保留了3%。
图8：提出的AlgE7在M-残基(XMMX底物)上的异构化和裂解反应机理。04
结论
综上所述，这些结果支持了先前的数据，即双功能AlgE7中的异构化和裂解酶活性共享相同的催化位点。这两种活性相互影响，产物的形成高度依赖于酶作用于哪种底物。利用定义明确的底物PolyM和PolyMG，发现裂解酶的优先裂解位点为M
XM和G
XM。通过氨基酸置换和结构分析获得的机理见解表明，M-残基上更有可能是催化反应机理，其中H在反应中起催化碱(或AA2)的作用，而Y起催化酸(或AA3)的作用。变异体RG位于催化残基Y旁边，几乎消除了所有裂解酶活性，但保留了异构化活性。对于裂解反应，R可能影响Y是将质子给糖苷键还是给糖环的另一侧。从鉴定的反应产物中也可以看出G-残基的裂解。反应条件对酶活力有影响，较高的NaCl降低裂解酶活力，增加G-阻滞形成，而高钙浓度则提高裂解酶活力，减少G-阻滞形成。这项研究的发现解释了AlgE7双重活性背后的机制基础，这与AlgEs的主要是差向异构酶活性相比较。对这两种活性如何在氨基酸残基和反应条件方面相互调节的新见解，将有助于AlgEs在褐藻胶降解方面的应用。
原文标题：AmechanisticbasisforunderstandingthedualactivitiesofthebifunctionalAzotobactervinelandiimannuronanC‐5epimeraseandalginatelyaseAlgE7
DOI：10./.03.31.END
前期回顾
通过湿法纺丝工艺从Chondrus中提取卡拉胶纤维扫描