导读
肺部感染在囊性纤维化（cysticfibrosis，CF）发病中起重要作用。CF呼吸道现在被认为是存在多种微生物的小生境，而高通量测序的发展使得我们能够分析其中的微生物群落。然而到目前为止，还没有对CF肺恶化（CFpulmonaryexacerbation，CFPE）期间的微生物群进行NGS研究的报道。该文章作者对33名有CFPE和没有CFPE患者的痰液进行16S和ITS2高通量测序，建立了跨界网络，并采用Phy-Lasso方法强调成分数据的相关性。这是第一次将记录的微生物群落数据转化为一个全新的生态顶点/攻击模型，该模型为思考CF肺疾病的生理病理特征以及治疗方法的改进打开了新的思路和前景。
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文献ID
英文题目：Respiratorymycobiomeandsuggestionofinter-kingdomnetworkduringacutepulmonaryexacerbationincysticfibrosis
中文题目：呼吸道菌群提示囊性纤维化疾病中的急性肺恶化
期刊名：ScientificReportsIF：4.
年份：年
通讯作者：LaurenceDelhaes
通讯单位：法国里尔大学
材料与方法
本研究纳入的CF患者来源于一项为期三年的多国家中心前瞻性研究中的人群，连续收集了37名患者（19名来自里尔，3名来自敦刻尔克，15名来自格勒诺布尔）的痰液样本进行NGS测序分析。
研究成果
1、患者临床特征
根据筛选条件，排除样本2、7、28、35，剩余33例样本继续分析。表1展示了患者的临床基本数据、肺活量、痰培养结果以及采样时的治疗情况等信息。患者被分为2组，其中一组有CEPE（n=17），另一组没有（n=16）。根据BMI、S-K评分和肺活量测定数据来看，患者处于CF病的中晚期，伴有几种并发疾病（外分泌胰腺功能紊乱占90%，糖尿病或糖耐量受损占33%）。培养结果以铜绿假单胞菌为主（96.7%，表1），还有一名患者（23岁的女性，患者14）真菌培养阳性。白色念珠菌、其他念珠菌和烟曲霉菌分别在66.6%、18.2%和66.6%的患者中被观察到。大部分的患者接受rhDNAse和/或吸入类固醇（%）、低剂量阿奇霉素（69.7%）和抗生素治疗（90.1%口服）。对1名符合ABPA的患者进行了抗真菌治疗。另外11名（33%）患者接受了全身类固醇治疗，未接受其他全身免疫抑制剂治疗。这些数据在有CFPE和无CFPE患者之间没有显著差异，但年龄中位数在CFPE患者中明显降低。
表1患者临床特征
2、FEV1与alpha多样性变化有关，CFPE与少数群体的变化有关
图1展示了患者肺部微生物组成及其组间变化。这些微生物与培养结果一致（表1）。然而通过NGS方法展示出了肺部更大的微生物多样性，这是显而易见的。细菌群落的FEV1值与Chao1指数之间存在显著线性正相关关系（图1a）。CFPE患者呼吸道中嗜血杆菌、奈瑟氏菌、枝孢菌明显减少，细菌相对丰度的变化与真菌和细菌少数群体的alpha多样性的降低显著相关（表2）。为了更好地评价微生物群落间的平衡，作者依据先前在IBD中报道的方法，应用了真菌与细菌多样性的比率。这个比值显示出细菌对真菌的优势，中位数为0.64（IQR=[0.43;4.25]），不论是有无CFPE的患者，肺部细菌和真菌之间不存在显著的不均衡。担子菌/子囊菌的相对丰度比值的中位数为0.03（IQR=[0.01;0.19]）。
图1轻度、中度、重度CF患者痰液微生物多样性和结构特征
表2CF肺恶化和无恶化患者肺部总体微生物、少数微生物和多数微生物的α多样性和丰度差异
3、跨界相关与网络分析
研究通过构建整个NGS数据集的属级关联矩阵分析细菌和真菌之间的共存或缺失模式并用图形网络来展示（图2和3）。通过绘制细菌属图谱，研究人员推断出一个跨界网络，它与至少一个真菌属显著相关，反之亦然。该网络由26个节点和23个边缘组成，主要分为以曲霉菌、念珠菌和丝孢菌属为主的3个集群和另外三对不相连的微生物（图2）。这3对不相连的微生物中，有两个包含环境真菌:柱孢属（一种植物病原体）和青霉菌。这些真菌很可能是环境中短暂的真菌要素。模型中确定的6个负相关的OTU中，镰刀菌与孪生球菌呈负相关，后者被认为是预测CFPE的关键属。此外，曲霉属与链球菌属、韦荣球菌属、密螺旋体属、颗粒链菌属呈正相关；丝孢菌属与微单胞菌属、孪生球菌属、福赛斯坦纳菌等也呈正相关关系。该网络结果优先将真菌与CFPE期间发现的细菌种群相关联，可以被看作是生态顶点/攻击模型（CAM）中的攻击种群。
图2细菌和真菌间的共线性网络（灰线代表正相关，红线代表负相关）
图3细菌和真菌间的相关性分析
4、利用体外共培养评估网络互作
为了评估在相关矩阵分析中确定的相互作用，研究人员对烟曲霉、轻型链球菌和口腔链球菌进行了共培养实验。之所以选择这些微生物是因为它们在CF（种水平）中确立了医学重要性。正如预测的那样，烟曲霉的生长速度似乎受到了轻型链球菌和口腔链球菌的促进（图4）。研究发现烟曲霉的生长速度明显要长于链球菌（曲霉菌生长24-48小时相对于链球菌约1小时），它无法识别细菌的生长速度。
图4烟曲霉单独培养、烟曲霉与轻型链球菌/口腔链球菌共培养的生长曲线
5、囊性纤维化肺紊乱的微生物标志物
为了充分预测与肺功能改变相关的细菌和真菌群落，我们使用特征选择方法（bootstrap-enhancedPhy-Lasso）来识别与CFPE（图5a）和/或FEV1下降（图5b）相关的属。在患者的菌群中，嗜血杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属、念珠菌属、镰刀菌属、青霉菌属和丝孢菌属从个bootstrap重复中被选择次，这些菌属与CFPE的存在呈负相关。马拉色菌和曲霉属与CFPE呈正相关关系（图5a）。假单胞菌属、青霉菌属和丝孢菌属与FEV1呈负相关，它们相对丰度的增加与FEV1的降低相关（图5b）。这些结果强调了CF患者呼吸道微生物群落相互作用的复杂性，应该开发一种像CAM这样的生态模型。总的来说，该研究（跨界网络分析、体外共培养结果和基于bootstrap-enhancedPhy-Lasso的标志物选择）通过提出最新版本的CAM模型为人们从生态水平上了解真菌在CF肺部疾病中的作用铺平了道路（图6）。
图5通过bootstrap-enhancedPhy-Lasso特征选择性方法得到的与CFPE（a）heFEV1（b）相关的OTUs
图6根据前人以及本研究推断出的CF疾病CAM模型
研究结论
1）该研究表明CF患者呼吸功能下降与细菌多样性减少有关。
2）CF患者呼吸道菌群互作网络关系主要体现在曲霉属、念珠菌属和丝孢菌属。曲霉和马拉色菌与CFPE有关，丝孢菌和假单胞菌与肺功能下降有关。
3）该研究还通过相关网络证明曲霉菌和链球菌可以跨域互作。这是第一次将记录的微生物群落数据转化为一个全新的生态顶点/攻击模型，该模型为思考CF肺疾病的生理病理特征以及治疗方法的改进打开了新的思路和前景。
亮点
1）该研究首次根据CF患者呼吸道真菌数据对CAM模型进行和合理推测；
2）该研究证明利用NGS方法推理微生态互作网络和生态模型可帮助破译CF肺疾病的生理病理学发病机制，这将可以作为改善CF治疗方案的有用工具。
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公司于年获评“上海闵行十大科技创业新锐”企业称号，目前已在杭州、青岛等地成立区域中心，其中青岛医学检验所于年9月投入使用。
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